Infecting Glial Cells with Antimony Resistant Leishmania tropica: A New ex-vivo Model


Zorbozan O. , Harman M., Evren V. , Erdogan M. A. , Kılavuz A. , Tunalı V., et al.

MIKROBIYOLOJI BULTENI, cilt.52, ss.49-55, 2018 (SCI İndekslerine Giren Dergi) identifier identifier identifier

  • Cilt numarası: 52
  • Basım Tarihi: 2018
  • Doi Numarası: 10.5578/mb.66350
  • Dergi Adı: MIKROBIYOLOJI BULTENI
  • Sayfa Sayısı: ss.49-55

Özet

Leyşmanyazis; kutanöz, mukokutanöz, viseral ve viserotropik formlar gibi farklı klinik özelliklere  sahip vektör kaynaklı zoonotik bir hastalıktır. Leyşmanyazis ilaç tedavisinde kullanılan protokoller toksik etkilere sahiptir ve uygulamalar sırasında birçok kısıtlılık oluşmaktadır. Tedavi ile ilgili kısıtlılıklardan en önemlisi uygulanan protokollere karşı gelişen dirençtir. Özellikle dirençli hastalar için yeni tedavi seçeneklerinin geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Antimona direnci olan hastalarda yeni ilaç seçeneklerinin değerlendirilmesi için in-vitro ve in-vivo çalışmalara ek olarak, primer hücre kültürlerini kullanan ex-vivo modellerin iyi bir kaynak olabileceği düşünülmektedir. Bu çalışmada, tedaviye yanıt vermeyen kutanöz leyşmanyazisli hastalarda tedavi seçeneklerini değerlendirmek için yeni bir ex-vivo kültür modelinin tanımlanması amaçlanmıştır. Çalışmamızda oluşturulan deneysel ex-vivo enfeksiyon modelinde, önceden kutanöz leyşmanyazis tanısı almış bir olgudan elde edilen Leishmania tropica promastigot formu kullanılmıştır. Ex-vivo modeli için kullanılacak primer astroglial hücre kültürü, steril koşullar altında, 2-3 günlük yeni doğan Sprague Dawley sıçan beyinlerinden McCarthy yöntemi modifiye edilerek hazırlanmıştır. Yeterli yoğunluğa ulaşan astroglia hücreleri antimona dirençli L.tropica promastigotları ile enfekte edilmiştir. Yirmi dört saatlik inkübasyondan sonra, hücrelerin üzerinde bulunan üst sıvı toplanmış, hücre kültür plağı oda sıcaklığında kurutulduktan sonra metil alkol ile fikse edilmiş ve Giemsa boyası ile boyanarak L.tropica amastigotları tanımlanmıştır. L.tropica promastigotları ile enfekte edilen primer hücre kültürlerinde glia hücreleri içerisinde amastigotlar yoğun bir şekilde gözlenmiştir. Enfekte edilen plaklardan elde edilen sıvı besiyerinin santrifüjü sonrası dip çökeltiden hazırlanan yaymaların Giemsa boyası ile hazırlanan preparatlarında parazitin promastigot formu gözlenmemiştir. Bu çalışmada beş değerlikli antimon tedavisine yanıt alınamayan kutanöz leyşmanyazisli bir hastadan elde edilen promastigotların sıçan glia hücrelerini enfekte ederek amastigot formuna dönüştüğü gösterilmiştir. Oluşturulan bu amastigot glia hücre modeli bildiğimiz kadarıyla L.tropica ile oluşturulan literatürdeki ilk modeldir. Glia hücreleri içerisinde L.tropica amastigot şekillerinin görülmesi Leishmania türlerinin santral sinir sistemini enfekte edebileceğinin göstergesi olarak düşünülmüştür. Tedaviye yanıt alınamayan leyşmanyazis olgularında, santral sinir sistemi Leishmania amastigotlarının immün sistemden kaçması için uygun bir alan olarak gözükmektedir. Bu çalışma, glia hücrelerinin L.tropica amastigotları ile enfeksiyonunu gösteren ilk çalışma olması nedeniyle önem arz etmektedir.

Leishmaniasis; Is a vector-borne zoonotic disease with different clinical features such as cutaneous, mucocutaneous, visceral and viscerotropic forms. The protocols used in the treatment of leishmaniasis are toxic and have many limitations during administration. One of the limitations of treatment is the resistance against the protocols in practice. There is also a need to define new treatment options especially for resistant patients. Ex-vivo models using primary cell cultures may be a good source for evaluating new drug options in patients with antimony resistance, in addition to in-vitro and in-vivo studies. In this study, it was aimed to define a new ex-vivo culture model to evaluate treatment options in patients with cutaneous leishmaniasis who did not respond to treatment. In our experimental model of ex-vivo infection, Leishmania tropica promastigotes isolated from a case previously diagnosed with cutaneous leishmaniasis were used. The primary astroglial cell culture used for the ex-vivo model was prepared from 2-3 days old neonatal Sprague Dawley rat brains under sterile conditions by modifying McCarthy's method. The astroglia cells, which reached sufficient density, were infected with antimony resistant Leishmania tropica promastigotes. After 24 hours of incubation, the supernatant on the cells were collected, the cell culture plate was dried at room temperature, then fixed with methyl alcohol and stained with Giemsa to search for Leishmania tropica amastigotes. Amastigotes were intensely observed in glia cells in primary cell cultures infected with Leishmania tropica promastigotes. No promastigotes were seen on Giemsa stained preparations of the precipitates prepared from the bottom sediment after the centrifugation of the liquid medium removed from the infected plates. In this study, promastigotes from a cutaneous leishmaniasis patient unable to respond to pentavalent antimony therapy have been shown to infect rat glia cells and convert to amastigote form. This amastigote glial cell model, as we know it, is the first model in the literature produced by Leishmania tropica. The occurrence of Leishmania tropica amastigote forms in glia cells may be indicative of the ability of Leishmania species to infect the central nervous system. The central nervous system may be an area for the Leishmania amastigotes to escape from the immune system in cases of leishmaniasis with no treatment response. Our study is important because it is the first study to show the infection of glia cells with Leishmania tropica amastigotes.